Si le jeu de base ne permet de jouer qu'avec Isaac d'autres personnages se débloquent au fur et à mesure, voici leurs caractéristiques :

Isaac

• Vie : 3 cœurs
• Vitesse : 2
• Cadence de tir : 1
• Vitesse de tir : 2
• Attaque : 2
• Portée : 2
• Chance : 1
• Equipement de base : une bombe (puis, après avoir battu le Boss ??? avec le personnage ???, obtient le D6 (objet réutilisable) qui permet de changer un objet (dans une salle du trésor, par exemple)

Magdalene

• se débloque en ayant 7 conteneurs de cœurs ou plus en une partie

• Vie : 4 cœurs
• Vitesse : 1
• Cadence de tir : 1
• Vitesse de tir : 2
• Attaque : 2
• Portée : 2
• Chance : 1
• Equipement de base : Yum Heart (objet réutilisable rendant un cœur)

Cain

• se débloque en ayant 55 pièces ou plus en même temps dans une partie

• Vie : 2 cœurs
• Vitesse : 2
• Cadence de tir : 1
• Vitesse de tir : 2
• Attaque : 2
• Portée : 1
• Chance : 2
• Equipement de base : une clé et le Lucky Foot (augmente la chance du joueur)

Judas

• se débloque en battant Satan au moins une fois

• Vie : 1 cœur
• Vitesse : 2
• Cadence de tir : 1
• Vitesse de tir : 2
• Attaque : 3
• Portée : 2
• Chance : 0
• Equipement de base : trois pièces et le Book of Belial (augmente les dégâts du joueur jusqu'à la fin de la salle, réutilisable)

???

• se débloque en finissant 10 fois le jeu

• Vie : 3 cœurs gris de base (ne peut avoir que des coeurs gris)
• Vitesse : 2
• Cadence de tir : 1
• Vitesse de tir : 2
• Attaque : 2
• Portée : 2
• Chance : 1
• Equipement de base : l'objet "Poop" (fait apparaître un caca qui peut alors se détruire pour récolter des items)

Eve

• se débloque en ne prenant aucun coeur pendant au moins 2 étages

• Vie : 2 cœurs
• Vitesse : 3
• Cadence de tir : 1
• Vitesse de tir : 2
• Attaque : 1
• Portée : 2
• Chance : 1
• Equipement de base : le Dead Bird (inflige des dégâts aux ennemis à chaque fois que le joueur est touché) et le Whore Of Babylon (dès que le joueur n'a plus qu'un cœur il se transforme en démon et voit ses dégâts augmentés de trois jusqu'à ce qu'il regagne de la vie)

• Note: le Whore of Babylon peut fonctionner si, par exemple, vous avez 1 coeur rouge et plusieurs coeurs bleus ou noirs.

Samson

• se débloque en passant au moins 2 étage sans se prendre de dégats

• Vie : 3 coeurs
• Vitesse : 2
• Cadence de tir : 1
• Vitesse de tir : 2
• Attaque : 2
• Portée : 4
• Chance : 1
• Equipement de base : le Blood Lust (plus vous tuez d'ennemies, plus vous devenez puissant. L'effet de puissance se remet à zéro lors du passage à un nouvel étage)

Azazel

• se débloque en faisant au moins 3 pactes avec le Diable en une seule partie

• Vie : 3 coeurs noirs (les HP UP compteront toutefois comme des coeurs rouges)
• Vitesse : 2
• Cadence de tir : 1
• Vitesse de tir : 2
• Attaque : 3
• Portée : 1
• Chance : 1
• Equipement de base : un mini Brimstone (lazer rouge faisant d'assez gros dégats aux ennemies, mais avec une portée assez réduite) et la carte de tarot 0 - The Fool

Lazarus

• se débloque en ayant eu au moins 4 coeurs gris dans une partie

• Vie : 3 coeurs (+1 vie de base)
• Vitesse : 2
• Cadence de tir : 1
• Vitesse de tir : 2
• Attaque : 1
• Portée : 2
• Chance : -1
• Equipement de base : L'objet Lazarus Lags' permettant de bénéficier d'une deuxième vie après la mort. Lors de cette deuxième vie, l'attaque, la chance, la portée et la vitesse sont considérables augmentées. De plus, il a aussi une pillule, toujours bleue, mais à effets aléatoires.

Eden

• fonctionne par jetons : un jeton = Mom's Heart tuée une fois. Chaque fois que ce personnage est utilisé, consomme un jeton

• Vie : ??? (jusqu'à 3 coeur rouges de base)
• Vitesse : ???
• Cadence de tir : ???
• Vitesse de tir : ???
• Attaque : ???
• Portée : ???
• Chance : ???
• Equipement de base : Toutes les statistiques sont aléatoires lors de l'utilisation d'un jeton. Eden bénéficie néanmoins d'un objet activable, et d'un objet passif aléatoire. Peut aussi avoir entre 0 et 2 bombes, et entre 0 et 2 clés.

The Lost

• débloqué en faisant plusieurs manipulations avec différents personnages. Regardez ici pour plus d'informations : bientôt...

• Vie : 0 (et impossible d'en avoir)
• Vitesse : 2
• Cadence de tir : 1
• Vitesse de tir : 2
• Attaque : 2
• Portée : 2
• Chance : 1
• Equipement de base : Peut voler. 1 pièce.