Ce qui suit dévoile des moments clés de l’intrigue.
L'intrigue de Portal est révélée au joueur via des messages audio de GLaDOS et des salles annexes qui apparaissent dans les derniers niveaux. Lorsque le jeu commence, Chell se réveille et entend les instructions et avertissements de GLaDOS concernant l'épreuve à venir. Le début du jeu consiste en une phase de test où, petit à petit, le joueur découvre le gameplay de Portal. Les instructions et commentaires de GLaDOS servent non seulement à guider le joueur, mais aussi à créer une atmosphère et à présenter GLaDOS en tant que personnage12. On promet à Chell un gâteau en récompense si elle réussit dans toutes les salles de test22.
Chell se déplace à travers le Centre d'enrichissement vide, et n'interagit qu'avec GLaDOS. Au fil du jeu, les intentions de GLaDOS se révèlent plus sinistres que son attitude serviable ne pourrait laisser penser. Malgré la démarche apparemment utile et aimable de GLaDOS, ses actions et paroles suggèrent une insouciance pour Chell, ainsi qu'un manque de sincérité. Les salles de test deviennent de plus en plus dangereuses tandis que Chell les termine, et GLaDOS la dirige même dans « un parcours de tir créé pour des androïdes militaires » car la salle de test usuelle est en cours de rénovation. Cette salle de test, la seizième, contient des tourelles mobiles et automatisées qui tirent sur Chell, mais essayent de sympathiser avec elle après avoir été neutralisées, avec des phrases comme « Je n'vous en veux pas17,23. », « Sans rancune. » ou « Pourquoi moi ? ». Dans la salle suivante, GLaDOS parle de l'importance et de la qualité du « Cube de Voyage », un cube d'environ un mètre de côté marqué d'un cœur rose sur chaque face, pour ensuite lui annoncer qu'il devra « malheureusement être euthanasié » dans un « incinérateur autonome d'urgence » avant que Chell ne puisse continuer20.
Après que Chell a terminé le test de la dernière salle, GLaDOS la félicite mais dirige la plate-forme où elle se tient vers un grand fourneau, lui annonçant que toutes les technologies d'Aperture Science restent fonctionnelles jusqu'à « 4 000 kelvins ». Chell s'échappe grâce à l'arme à portails et s'aventure alors dans les secteurs de maintenance du Centre d'enrichissement, tandis que GLaDOS continue de lui envoyer des messages qui laissent progressivement entendre que ses systèmes sont corrompus et qu'elle pourrait être responsable de la mort de tout le personnel du centre. Ces « coulisses », dans un état de délabrement avancé, forment un contraste frappant avec les salles de test immaculées. Chell accède notamment aux salles d'observation - vides - donnant sur des salles de test qu'elle a auparavant parcouru, et repasse par la salle de test 9. Elle n'est plus guidée par GLaDOS, mais par des graffitis sur les murs, parmi lesquels apparaissent des pastiches de poèmes, notamment d'Emily Dickinson et de Henry Wadsworth Longfellow, ainsi que le message « le gâteau est un mensonge » (« the cake is a lie »), depuis utilisé par certains joueurs du jeu comme un idiome moderne12.
GLaDOS tente de dissuader Chell de continuer à s'enfoncer dans les zones de maintenance par des menaces et des mensonges. Chell finit par atteindre une grande salle où se trouve le « corps » physique de GLaDOS. Celle-ci continue à supplier Chell, mais durant le dialogue, l'une des sphères de GLaDOS tombe au sol, et Chell la jette dans un incinérateur. GLaDOS révèle qu'il s'agissait de son « processeur de moralité », que les employés d'Aperture Science avaient installé après que GLaDOS avait inondé le centre d'enrichissement avec une neurotoxine mortelle, et elle affirme que plus rien ne l'empêche de recommencer. Un compte à rebours de six minutes s'enclenche tandis que Chell déloge et incinère d'autres pièces de GLaDOS - successivement la curiosité, l'intérêt pour le gâteau, et la colère -, tandis que celle-ci tente de la dissuader par des insultes de plus en plus juvéniles. Après la destruction de la dernière pièce, un dysfonctionnement de GLaDOS détruit la pièce et transporte tout son contenu à la surface. Chell se retrouve à l'entrée du complexe, au milieu des débris de GLaDOS.
Le 3 mars 2010, quelques jours avant l'annonce de Portal 2, une mise à jour modifie la fin de la version PC : une fois à l'air libre, Chell, visiblement inerte mais consciente, est traînée sur le sol par une entité robotique invisible qui déclare « Thank you for assuming the party escort submission position » (« merci d'avoir adopté la position de sécurité [pour la fête] »), la fête étant ce que promettait GLaDOS si Chell se rendait après avoir échappé aux flammes.
Après un long parcours en caméra libre à travers les méandres internes du complexe, la scène finale montre une série d'étagères entourant une forêt noire24 surmontée d'une bougie, ainsi que le « Cube de Voyage ». Sur les étagères se trouvent des dizaines de sphères métalliques identiques à celles que le joueur vient de détruire dans son combat contre GLaDOS ; certaines s'allument avant qu'un bras robotique descende et éteigne la bougie25.
