tiens glast voici quelques elements de reponse, heu j´ai preferé creer un nouveau topic, parce que dans celui a l´autre abruti, ca va pas le faire.
Sorry pour ceux qui s´en tapent de ce genre de truc c´est juste une exception.
Comment faire pour bien reprogrammer un noyau au niveau génétique, après
une transfection ?
la surtout, c´est pas tres clair...reprogrammer, moi j´ai compris: certaines
cells peuvent se differencier apres une transfection. il faut donc leur
apporter qqch ( hormone ou autre) pour les dé-differencier en meme temps que
la transfection. ou sinon ca peut aussi vouloir dire que on veut toutes les
cellules de la boite, surtout les transfectees evidemment au meme stade du
cycle: donc la il faut les synchroniser, pendant ou apres la transfection.
valable surtout si on etudie une prot du cycle celulaire...
et par la même occasion aurais tu des astuces pour
augmenter le rendemment de la transfection de gènes ?
alors la, OUI, mais ca va pas te plaire comme reponse: ca s´appelle la mise
au point...bon, a savoir quie j´ai jamais bosse avec des levures, donc ce
que je dis est valable pour les mammalian cells. on peut essayer plusieurs
agents de transfection ( calcium phosphate, lipofectamin, exgen, etc..), mais
surtout optimiser les quantites d´adn et de transfectant...et pur ca ben ya
pas 36 solution, faut essayer de faire varier l´un sans bouger l´autre, et
voir le mieux. tu peux prendre un plamsid gfp pour faire ca, comme ca tu
peux voir directement l´efficacite sans trop travailler, juste a la fluo et
au comptage...
Connaitrais tu le bon voltage à appliquer pour l´electroporation ? Et la
durée ?
non, j´ai jamais electropore. le voltage doit se situer entre 200-400V si je
me rappelle, mais ca depend de l´eletroporateur utilise et des cellules. ( un
exemle de protocole pour les mammalian cells
:http://grimwade.biochem.u[...]
llbiol/cos7.htm )
est-ce mieux de le faire sur culture cellulaire ou sur l´ovocyte de
xénope ? Il me semble qu´il y a plus de casse sur culture.
oui, l´eletroporation abime pas mal les cells, mais c´est poas grave sauf
qu´il en faut pas mal au depart.. par contre electroporer les oocytes, je
sais pas trop, du moins je connais pas, en general on injecte le dna plutot
( dna ou rna directement injecte dans l´oeuf, " a la seringue")
Je voudrais pouvoir exprimer le gène d´un Transporteur du glutamate ( le
cDNA fait
moins de 5 Kbases) dans un modèle quelconque pour faire eventuellement de
l´electrophysiologie derriere ou du marquage immuno
ben, ca depend de ce que tu veux reellement faire: les oocytes c´est par
definition pas prevu pour se diviser. donc c´est efficace ( et rapide) si tu
veux faire de l´eletrophy sut ton Transporteur du glutamate, voir ses
caracteristik electrochimiques, voir des activateurs/inhibiteurs etc... mais
pas pour le l´IF ou d´autres etudes biochimiques.
tu entends quoi par " modele quelconque"? le marquage immuno c´est pour
tester des Ac ou bien voir la localisation??
si c´est pas pour faire que des mesures electrophy, mais aussi voir si ca
modofie l´expression de telle ou telle prots, la vitesse de pousse, etc, a
priori comme ca je prendrai plutot des mammalian cells. Trnasfection,
selection ( G418), isolation d´un clone et lignee stable. au moins tu es
tranquile tu peux comparer les cells " natives" et les transfectees ( qui sont
transfectees 100% puisque stables). et tu peux toujours les patcher si
jamais. inconvenient, ca mets 2-3 mois pour la selection
et l´obtention d´une lignee stable. avantage: tu es tranquille apres, tu
surexprime en permanence la prot transfectee.
