La partie qui suit peut contenir des spoilers. Le deuxième volet de la série est la suite directe du précédent. On retrouve donc Desmond, dans les laboratoires d'Abstergo. Lucy, en réalité Assassin, apparaît et nous enjoint de quitter les lieux avec elle. Après une évasion quelque peu mouvementée, Desmond est conduit dans une planque d'assassins. Vraisemblablement, les Assassins poursuivent le même but que les Templiers : mettre la main sur les artefacts. Altaïr en possédait un mais il semblerait que l'objet ait disparu de la circulation. Une fois de plus, Desmond sera projeté dans le passé, à la recherche de l'objet. Cette fois, il revit les aventures de son ancêtre italien, Ezio Auditore da Firenze (de Florence, en italien), en pleine période phare de l'humanité : la Renaissance.

Ezio est un jeune homme provocateur et sûr de lui. A l'instar de Desmond, il ignore tout des Assassins et de leur opposition aux Templiers. Il l'apprendra malgré lui, tandis que sa famille est victime d'un complot. Arrivé trop tard pour éviter la pendaison de son père et de ses frères, il sera projeté bien malgré lui dans une lutte sans merci qui durera presque toute sa vie. Eliminant un à un les protagonistes liés à cette affaire, il découvrira l'énorme pouvoir détenu par les Templiers. L'artefact tant convoité (appelé « la Pomme d'Eden ») dévoile alors toute sa puissance, permettant de gagner les hommes à la cause de celui qui l'emploie. Ezio participera alors à tous les événements importants qui ont secoué l'Italie de la fin du quinzième siècle, de la conjuration des Pazzi et l'attaque des Medicis à la prise de pouvoir de Florence par Savonarolla en passant par les intrigues politiques de Venise.

Durant son aventure, Ezio découvre ses origines et l'appartenance de sa famille à l'Ordre des Assassins, dont l'influence a perduré à travers les siècles. Mais s'il éprouve d'abord de la haine pour ceux qui ont provoqué la mort des siens, il finira par admettre le crédo comme son nouveau guide. Il acceptera aussi le fait de n'éprouver aucune haine pour ses ennemis. La fameuse phrase, « Requiescat in pace » (Repose en paix) qu'il prononce d'ailleurs à ses victimes, témoigne de sa lente accession au statut de maître assassin.