Le premier volet de la série plonge le joueur au moment où Desmond revit pour la première fois les souvenirs de son ancêtre Altaïr Ibn-La'Ahad. Fraîchement kidnappé et découvrant à peine son nouvel environnement, Desmond est aussitôt propulsé quelque huit siècles plus tôt, via l'Animus. L'action se déroule en Palestine à la fin du XIIème siècle, durant la troisième croisade. Altaïr (qui signifie « Aigle » en arabe) est un maître assassin et un membre éminent de l'Ordre des Assassins. Toutefois, il perd son titre et son honneur en bafouant le crédo des Assassins et fait échouer une mission importante, entre autres à cause de son impulsivité. Néanmoins, Al Mualim, le maître de l'Ordre, lui laisse une chance de se racheter. Et c'est au travers de neuf missions plus risquées les unes que les autres qu'Altaïr devra prouver qu'il respecte désormais le code sacré des Assassins. Parallèlement à la rédemption d'Altaïr, Al Mualim dévoile l'existence des artefacts et leurs pouvoirs « divins », privant les hommes de leur libre arbitre.
Les neuf missions représentent autant d'assassinats à effectuer dans trois grandes villes de l'époque : Jérusalem, Damas et Acre. A ces cités viennent s'ajouter la campagne environnante ainsi que le village de Masyaf, fief des Assassins. Le réalisme est stupéfiant, les cités sont grandes et reproduisent fidèlement l'ambiance de l'époque (du moins telle qu'on peut se l'imaginer), chaque détail est peaufiné... Bref, on s'y croirait. Les cibles d'Altaïr sont naturellement des Templiers et on apprend donc que la lutte entre les deux groupes remonte au moins jusqu'aux croisades.
Il ne faut pas attendre la fin du jeu pour se rendre compte qu'Abstergo avait vu juste : Al Mualim explique à Altaïr que les Templiers ont bel et bien dérobé un artefact dans le temple de Salomon et qu'il faut à tout prix le leur reprendre. Altaïr voit là enfin une occasion d'éponger sa faute en ramenant à son maître l'objet tant convoité...
Cinématique d'introduction