Le deuxième volet apporte son lot de nouveautés. Parmi celles-ci, on remarque d'emblée une meilleure fluidité des mouvements. Alors qu'Altaïr avait parfois du mal à gravir certains murs ou qu'il prenait une mini pause entre chaque prise, Ezio grimpe à peu près partout comme s'il était aussi à l'aise que sur la terre ferme. Il peut aussi sauter pour agripper une prise qui se trouve plus haut. Les combats ont aussi été revus. Ezio peut s'équiper avec davantage d'armes et peut ramasser celles qui traînent par terre. Il peut même voler celles des ennemis. Les enchaînements et les manières de finir ses adversaires sont aussi plus nombreux. Contrairement à Altaïr, Ezio peut nager, ce qui semble tout de même la moindre des choses, surtout pour un assassin d'élite !

Le deuxième opus introduit aussi la notion d'argent. Pour chaque mission réussie, Ezio gagne un petit pécule qu'il peut dépenser dans les boutiques des villes. Armes, armures, munitions, tenues et œuvres d'art son autant d'objets qu'il peut acheter pour améliorer son quotidien, accroître sa résistance ainsi que ses performances au combat. Il existe aussi désormais un tout nouveau système d'amélioration de bâtiments. En effet, la famille Auditore possède une ville en Toscane, à Monteriggioni. A chaque fois qu'Ezio y restaure un édifice, il perçoit une quantité d'argent toutes les vingt minutes. Le fait de perfectionner son équipement et d'acheter certains objets augmente encore ses revenus. Des factions font aussi leur apparition. Moyennant un peu d'argent, il est donc possible de louer les services de mercenaires, de voleurs ou de courtisanes qui iront alors distraire les gardes sur commande. Ezio peut aussi maintenant se cacher parmi la foule, sans risquer de se faire repérer.

Enfin, les ennemis sont plus variés. En plus des gardes de base et des archers, des adversaires en armure ainsi que des soldats agiles font leur apparition. Ils ont tous leurs caractéristiques et les moyens pour les éliminer sont donc différents. Quelques armes plus modernes sont aussi présentes. Ezio peut donc utiliser un pistolet pour tuer à distance, des bombes de fumigène pour étourdir ses ennemis, du poison pour pousser un ennemi à attaquer tout ce qui passe à proximité, etc. Le système de synchronisation est légèrement différent. La barre s'agrandit en fonction de l'armure qu'Ezio porte. Il est d'ailleurs possible d'acquérir les ustensiles d'Altaïr, notamment son armure en effectuant des missions spéciales. Ces objets offrent les meilleures caractéristiques, et donc une efficacité maximale. Il est possible de se soigner à tout moment, à condition d'avoir l'objet adéquat ou d'aller voir un médecin. Néanmoins, comme dans le premier opus, Ezio respecte le crédo. Lorsqu'il tue un innocent, il ne perd pas de vie mais s'il en tue plus de deux à la suite, Desmond est désynchronisé.