Le succès de Donkey Kong aidant, Mario revient rapidement squatter les salles d'arcade dans un jeu qui peut être véritablement considéré comme étant le tout premier volet de la série. Mario Bros. a été développé pour l'arcade grâce aux talents conjugués de Shigeru Miyamoto et Gunpei Yokoi (l'inventeur de la Game Boy). Le soft était même jouable à deux simultanément, suite à l'arrivée de Luigi au sein de l'équipe, justifiant ainsi l'appellation de « Mario Brothers ».
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Le jeu était construit sous forme de tableaux à « nettoyer » en éliminant les tortues qui sortaient des tuyaux. Sur le papier, Mario Bros. présentait déjà tous les éléments annonciateurs de la série. Contrairement à Donkey Kong, les deux personnages pouvaient sauter de n'importe quelle hauteur sans risquer de s'écraser au sol, ce qui permettait au joueur d'exploiter la totalité de l'écran pour surprendre son adversaire. Le fait que le jeu soit placé sous le signe de la compétition constitue d'ailleurs le principal intérêt de Mario Bros. en arcade.
En dépit de son insolente simplicité, le gameplay s'avère tellement bien ficelé qu'aucune partie ne se reproduit jamais à l'identique. Les joueurs doivent frapper les ennemis par en dessous pour les renverser, puis monter à leur hauteur pour les éliminer, ce qui permet de faire apparaître une pièce à l'écran qu'il faut aller chercher avant son adversaire pour marquer un point. Dans un souci de crédibilité, les ennemis capables de se relever si le joueur ne les éliminait pas rapidement se sont retrouvés être des tortues qui deviendront les fameuses tortues Koopas indissociables de la série.
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Conscient de l'énorme potentiel ludique de Mario Bros. lors des parties à deux joueurs, Nintendo aura plus tard la bonne idée d'intégrer le jeu en bonus dans certains remakes, notamment sur GBA, afin que les jeunes générations découvrent elles aussi ce titre sans lequel Super Mario Bros. n'aurait sûrement jamais vu le jour. Même si on ne parlera pas ici des Game & Watch, il ne faut pas oublier non plus que le personnage de Mario est apparu également dans de nombreux jeux électroniques, à l'époque où tout était encore à faire dans le milieu du jeu vidéo.